Oyunun konusu, italya'da bulunan ve aslında kiliseye bağlı olarak faaliyet gösteren gizli bir topluluğun klonlama tekniği kullanarak suçlularla savaşacak seçkin bir "suç karşıtı" birimi yaratmasına dayanmaktadır. Bu yaratılan bireyler birer profesyonel savaş makinesi olarak yetiştirilmekte ve bunlara "Ajan" denilmektedir. Her yaratılan ajanın bir de ayrıca numara kodu bulunmaktadır. Oyunun esas kahramanı, bu yaratılan özel anti-suç biriminin oldukça başarılı bir üyesi olan "47 Numaralı Ajan" (veya Ajan 47) çevresinde gelişmektedir.
Ajan 47 (Hitman) dünyanin en tehlikeli suçlularin DNA'lari tarafindan yaratılmış bir klondur. Romanya'da 5 Eylül 1964 tarihinde yeraltı bir klonlama laboratuvarında Dr. Wolfgang tarafından süper kiralık katiller operasyonunda yaratilmıştır, operasyonun amaci bu DNA'larla bir ordu kurmaktı. Diğer klonlarıyla beraber laboratuvarda büyüyen Hitman/Agent 47 henüz 6 yaşındayken profesörleri yetenekleriyle hayretler içine düşürmüştür hem fiziksel hem de psikolojik olarak. Sosyal açıdan çok sessizdi, ve her zaman etrafındaki kişilere dikkat ederdi. Ancak hızlılığı ve soğuk kanlılığı ilk olarak 1984'te görünmüştür, bu dönemde bir doktora muayene amacıyla gönderilen Hitman/Agent 47 bulabildiği bir iğneyi doktora defalarca batırmıştır. Ağır yaralanan doktor bulunduktan sonra, Ajan 47'nin kendisi için çok hızlı ve fazla güçlü olduğunu belirtmiştir. Olaydan sonra sorunsuz bir şekilde hücresine geri gönderilen Ajan 47, kaçmayı başarır, bunu yapmasınin sebebi bazı kesimlerin ona fazla yaklaşmasından dolayıydı. Yillar sonra laboratuvara geri dönen Ajan 47, klon yapımı ile ilgili dosyalari ele geçirmek için yaratıcısını ve diğer klonlarını öldürür. Bir kiralık katil firmasi "ICA HQ" (International Contract Agency Headquaters) için çalışmaya başlayan Ajan 47'nin yine buradan tek temas ettiği kişi Diana adında bir kimsedir (kendisi hakkinda tek bilinen budur). Çok sayıda tanınmış ve tanınmamış insanı öldüren 47, kendi alanında uzmandır. Aslında FBI ve CIA böyle bir kişinin var olmadiğını öne sürer ve aslında sadece kendisi ilk ve tek yasayan 1. sınıf insan klonudur. işini iyi yapmasına rağmen başı beladadır. Çünkü, 47'nin DNA'sı insan klonlamaları için bir tariftir ve bir yandan onu ele geçirip DNA'sını kullanip ordu kurmak isteyenler, diğer taraftan ise herhangi bir ordu olayını önlemek için onu öldürmek isteyenler vardır.
