Amerikaya yerleşen ikinci kolonidir. 1587'de North Carolina açıklarındaki Roanoke Adasına yerleşmişler ve 1590 yılında arkalarında hiçbir iz bırakmadan ortadan kaybolmuşlardır. Bu ortadan yokoluş hakkında çeşitli teoriler üretilmiş olsa da, bu kolonidekilere ne olduğu hakkında kesin bir bilgi yoktur.
1585 yılında, Sir Walter Raleigh tarafından gönderilen 100 kişi, Roaneke Adasında ilk ingiliz kolonisini kurmuşlardır. Raleigh bu adanın ispanyollarla savaşacak olan ingiliz savaş gemileri için mükemmel bir liman olduğunu düşünmüştü. Gemilerin onarımı burada yapılabilir, eksik cephane ve gıdaları tamamlanan gemiler savaşa tekrar dönebilirlerdi. Ama plan basarîli olamadı. Topraklar hem kolonileri, hem de civardaki Kızılderililerin ihtiyaçlarını karşılayacak kadar bereketli değildi, üstelik adanın etrafındaki suların sığlığı, gemilerin adaya yeterince yaklaşmasına engeldi. Böylelikle ertesi yıl kolonidekiler ingiltereye geri dönmeye karar verdiler. Bu sırada Raleigh ingiltereden bir grup kolonisi daha göndermişti. Yeni grup, ilk yerleşen kolonistlerin ayrılmasından birkaç gün sonra adaya ulaştıklarında, 15 kişi hariç herkesin ingiltereye geri dönmüş olduğunu öğrendiler.
1587 yılının ilkbaharında Raleigh yeni kıtaya bir grup kolonist daha gönderdi. Fakat gemiler daha kuzeydeki (şimdiki Virginia) Chesapeake körfezi yakınlarına doğru hareket ettiler. Gemiler temmuz ayında Outer Bankse ulaştılar ama donanma komutanı, kolonidekilerin Roanoke adası yerine, bu yeni limana yerleşme isteklerini kabul etmedi ve kolonistleri Roanoke Adasına bıraktı. Koloni lideri John White ki kendisi adaya ilk yerleşen ingiliz kolonisindendi, 1587'nin ağustos ayında, ingiltere malzeme tedariki için geri döndü. Fakat ingiltere ve ispanya arasında devam etmekte olan savaş, adaya geri dönmesini üç yıl kadar ertelemesine neden oldu. Ağustos 1590'da Roanoke Adasına geri dönen John White ailesi ve yüz kadar kolonist tarafından karşılanmayı beklerken, koloninin terk edilmiş olduğunu gördü.
John Whitein rastladığı tek ipucu bir ağacın üzerine kazılmış olan Croatoan kelimesi idi. Croatoan ya da Hatteralar, adanın güneyinde yaşayan ve kolonistlere dostane davranan kizilderililerdi. John White kolonositlerin Hatteralara katılıp katılmadıklarını öğrenmek için araştırmalara başladı ancak hava koşulları yüzünden araştırmasını tamamlayamadan ingiltereye geri dönmek zorunda kaldı.
Koloniye yerleşenlerin kaybolması ile ilgili iki teori üretildi. ilki, daha en basında Chesapeake Körfezine gitmek isteyen kolonistlerin, buraya hareket ettikleri ve Kızılderili direnişi ile karsılaşıp öldükleri. Diğer teori ise kuzey Carolinadaki diğer kızılderili kabilelerine entegre oldukları. Kolonistlere ne olduğu bilinmiyor, haklarında tek söylenebilecek şey bir daha Avrupalılar tarafından görülmedikleri.
